在生物學(xué)研究中，系統(tǒng)發(fā)育分析是揭示物種進(jìn)化關(guān)系的核心手段，而MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）軟件憑借其強(qiáng)大功能與友好界面，成為科研人構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的得力助手。無(wú)論是剛?cè)腴T(mén)的科研小白，還是想提升分析效率的老手，這篇全流程教程都能幫你輕松掌握MEGA系統(tǒng)發(fā)育分析的核心操作！

一、前期準(zhǔn)備：數(shù)據(jù)與軟件就位

1. 數(shù)據(jù)獲取

首先，需要準(zhǔn)備用于分析的序列數(shù)據(jù)，可以是DNA、RNA或蛋白質(zhì)序列。常見(jiàn)的數(shù)據(jù)來(lái)源包括NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)、Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)等。下載數(shù)據(jù)時(shí)，建議將序列保存為FASTA格式，該格式以“>"開(kāi)頭標(biāo)注序列名稱(chēng)，后續(xù)MEGA軟件能直接識(shí)別。

2. MEGA軟件安裝

前往MEGA網(wǎng)站下載對(duì)應(yīng)系統(tǒng)版本（Windows、Mac或Linux），安裝過(guò)程一路默認(rèn)即可。目前最新版本為MEGA 12，功能更強(qiáng)大，操作更流暢。

MEGA軟件的頁(yè)面如下圖所示，選擇對(duì)應(yīng)系統(tǒng)和版本后，點(diǎn)擊DOWNLOAD按鈕進(jìn)行軟件下載。

用戶(hù)協(xié)議頁(yè)面，下拉到最后點(diǎn)擊Accept跳轉(zhuǎn)到下一個(gè)頁(yè)面：

填寫(xiě)完畢相關(guān)信息后，繼續(xù)點(diǎn)擊DOWNLOAD。

彈出此頁(yè)面后稍等幾秒鐘即可開(kāi)始下載，下載完畢后安裝即可使用：

二、實(shí)戰(zhàn)操作：從序列比對(duì)到進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

總共分為4步：序列導(dǎo)入，序列比對(duì)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，結(jié)果保存。接下來(lái)請(qǐng)看詳細(xì)步驟。

1. 序列導(dǎo)入

（1）首先需要準(zhǔn)備一個(gè)fasta格式的序列文件，里面是需要進(jìn)行比對(duì)的序列。

（2）打開(kāi)MEGA軟件，點(diǎn)擊菜單欄“File"→“Open A File/Session"，選擇已準(zhǔn)備好的FASTA文件，點(diǎn)擊align進(jìn)行比對(duì)。導(dǎo)入后，數(shù)據(jù)會(huì)顯示在主窗口中，此時(shí)可先檢查序列長(zhǎng)度、名稱(chēng)是否正確。

（3）點(diǎn)擊后的頁(yè)面如下，點(diǎn)擊“File"→“Font"可以對(duì)字體進(jìn)行調(diào)節(jié)。

2. 序列比對(duì)

（1）多序列比對(duì)（Multiple Sequence Alignment）：點(diǎn)擊“Alignment"→“Align by ClustalW"或“Align by MUSCLE"，軟件將快速完成比對(duì)。

（2）這里以ClustalW為例，上方點(diǎn)擊Align by ClustalW后，出現(xiàn)如下的參數(shù)選擇頁(yè)面，一般情況下全部使用默認(rèn)參數(shù)即可，點(diǎn)擊右下角的OK選項(xiàng)進(jìn)行比對(duì)。

（3）比對(duì)完成后界面如下，比對(duì)完成的序列可以通過(guò)點(diǎn)擊“Data"→“Save Session"保存比對(duì)結(jié)果，格式為“.meg"。

3.系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

（1）選擇建樹(shù)方法：點(diǎn)擊“Phylogeny"，常見(jiàn)方法有鄰接法（Neighbor-Joining, NJ）、最大似然法（Maximum Likelihood, ML）等。NJ法計(jì)算快，適合初步分析；ML法更精確，適合復(fù)雜數(shù)據(jù)集。

（2）參數(shù)設(shè)置：以NJ法為例，點(diǎn)擊“Construct/Test Neighbor-Joining Tree"，在彈出窗口中，“Test of Phylogeny"選擇“Bootstrap method"，一般設(shè)置1000次重復(fù)以評(píng)估樹(shù)的可靠性；選擇用p-distance方法進(jìn)行計(jì)算，其他參數(shù)保持默認(rèn)即可。

（3）這樣，我們就得到了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖。注意這里有兩張圖，第一張original tree是可以通過(guò)分支長(zhǎng)度表達(dá)遺傳距離的圖，第二張bootstrap consensus tree是有自展值的圖。一般情況下選用origin tree圖即可。

進(jìn)化樹(shù)解讀

l  分支長(zhǎng)度：代表序列間的進(jìn)化距離，越長(zhǎng)說(shuō)明差異越大。

l  Bootstrap值：分支上的數(shù)值（如>70%）越高，表明該分支可靠性越強(qiáng)。

l  聚類(lèi)關(guān)系：同一分支的物種親緣關(guān)系更近，反映進(jìn)化歷程。

（4）通過(guò)菜單欄和左側(cè)的工具欄，可對(duì)生成的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行美化，這里選擇把系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)從長(zhǎng)條狀變成圓形，同時(shí)也可以編輯分支的粗細(xì)和字體等。

4. 結(jié)果保存

（1）保存樹(shù)文件：點(diǎn)擊“File"→“Export Current Tree (Newick)"，選擇“.nwk"格式，方便后續(xù)用其他軟件編輯。

（2）保存圖片：右鍵點(diǎn)擊樹(shù)圖空白處，選擇“Copy to Clipboard"或“Export Image"，支持PNG、PDF等格式，滿(mǎn)足論文投稿或匯報(bào)需求。

保存選項(xiàng)可以選擇是否保留分支長(zhǎng)度和自展值，建議都勾選上。

（3）最后推薦一個(gè)可以美化進(jìn)化樹(shù)的在線iTOL，上傳保存的進(jìn)化樹(shù)文件后，可以進(jìn)行更加精細(xì)的美化。

三、避坑指南：新手常見(jiàn)問(wèn)題解決

序列比對(duì)錯(cuò)亂：檢查序列是否有非標(biāo)準(zhǔn)字符（如空格、特殊符號(hào)），或嘗試更換比對(duì)算法。

Bootstrap值過(guò)低：可能是數(shù)據(jù)量不足或序列差異過(guò)大，可增加樣本或調(diào)整建樹(shù)方法。

軟件閃退：關(guān)閉不必要的后臺(tái)程序，或嘗試降低參數(shù)（如減少Bootstrap重復(fù)次數(shù)）。

四、文獻(xiàn)案例

文章標(biāo)題：Anther-specific expression of MsMYB35 transcription factor in alfalfa (Medicago sativa L.) and its crucial role in pollen development

中文：紫花苜蓿中MsMYB35轉(zhuǎn)錄因子的花藥特異性表達(dá)及其在花粉發(fā)育中的關(guān)鍵作用

發(fā)表年份：2025年

期刊：The Plant Journal

研究背景：

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是一種優(yōu)質(zhì)的飼料作物，是畜牧業(yè)的重要資源。了解紫花苜蓿雄性不育的分子機(jī)制對(duì)于開(kāi)發(fā)優(yōu)質(zhì)牧草品種至關(guān)重要。盡管花藥發(fā)育在植物繁殖中起著關(guān)鍵作用，但其分子調(diào)控機(jī)制，特別是轉(zhuǎn)錄因子在苜蓿中的參與仍未得到充分探索。

研究結(jié)果：

首先通過(guò)Protein BLAST，顯示MsMYB35與其他物種的MYB35家族成員具有高度序列相似性，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示MsMYB35與擬南芥的MYB轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān)。此外，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)使用了來(lái)自多個(gè)物種的同系物進(jìn)行樹(shù)木分析，結(jié)果（圖1A）表明MsMYB35與MtMYB35、PsMYB35、TrMYB35和GmMYB35 密切相關(guān)，形成一個(gè)具有高bootstrap值的強(qiáng)進(jìn)化枝 （100），表明具有相當(dāng)大的進(jìn)化相似性。將MsMYB35與M. truncatula、Melilotus albus、G. max、P. sativum、T. repens和A. officinalis的氨基酸序列進(jìn)行同源氨基酸序列比對(duì)。結(jié)果表明，MsMYB35包含R2R3-MYB家族的經(jīng)典R2R3結(jié)構(gòu)域（圖1B）。

基于對(duì)MsMYB35蛋白N端R2R3結(jié)構(gòu)域的鑒定，將其歸入R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族。綜合DAP-seq和RNA-seq分析顯示，MsMYB35直接調(diào)控兩個(gè)關(guān)鍵的花藥發(fā)育相關(guān)基因。功能分析表明，MsMYB35的過(guò)表達(dá)促進(jìn)花藥發(fā)育，而沉默MsMYB35會(huì)導(dǎo)致花藥囊缺陷和花粉粒起皺。適當(dāng)?shù)腗sMYB35表達(dá)可確保形成有活力和可育的花粉粒，鞏固其作為花藥發(fā)育關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的作用。

圖1. MsMYB35的氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析。

根據(jù)以上內(nèi)容可以看出，系統(tǒng)發(fā)育分析的意義在于它幫助我們理解物種之間的進(jìn)化關(guān)系。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，我們可以直觀地展示不同物種或同一物種不同族群之間的親緣關(guān)系。這種分析不僅用于研究物種的起源和演化，還能為生物分類(lèi)、生態(tài)學(xué)研究和疾病控制提供重要信息。系統(tǒng)發(fā)育分析通過(guò)數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法，能夠揭示生物間的相似性和差異性，從而為生物學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

Cai H, Zhang S, Wang Y, Yang Z, Zhang L, Zhang J, Zhang M, Xu B. Anther-specific expression of MsMYB35 transcription factor in alfalfa (Medicago sativa L.) and its crucial role in pollen development. Plant J. 2025 Apr;122(1):e70126.